Diagnostik dan pemantauan merupakan bagian penting dari setiap strategi pengendalian penyakit dalam dunia kedokteran hewan. Tanpa pengetahuan tentang bagaimana intervensi tertentu berdampak pada perkembangan penyakit dalam suatu flok, akan mustahil untuk merancang strategi pemantauan yang efektif.

Hal ini juga berlaku dalam pengendalian mikoplasma. Bahkan bisa dikatakan sangat penting, karena penyakit mikoplasma jarang muncul sendiri tanpa disertai penyakit lainnya.

Di beberapa wilayah dunia, Mycoplasma gallisepticum (MG) dan Mycoplasma synoviae (MS) menunjukkan tingkat prevalensi yang tinggi dalam produksi unggas intensif. Hal ini perlu diperhatikan karena penyakit ini dapat mengganggu sistem kekebalan tubuh dan memperburuk kerusakan yang disebabkan oleh patogen sekunder.

Selain masalah pernapasan dan sendi, MG dan MS menyebabkan kerugian produksi yang besar, baik pada ayam petelur dan pembibit maupun pada broiler. Mereka dapat memengaruhi fertilitas, viabilitas embrio, produksi dan kualitas telur pada ayam petelur dan pembibit. Semua ini akan menyebabkan komplikasi dengan infeksi sekunder dan superinfeksi yang umum terjadi.

Tanpa informasi tentang kejadian penyakit yang sebenarnya di lapangan dan dampaknya terhadap data produksi, maka hasil tes diagnostik seperti ELISA atau PCR akan kehilangan sebagian besar kegunaannya.

Pendekatan yang lebih holistik diperlukan: hal ini mencakup diagnostik dan tindakan intervensi tepat waktu seperti pengobatan, vaksinasi dan biosekuriti. Dalam artikel ini akan dibahas pilihan dan kegunaan metode diagnostik untuk pengendalian mikoplasma pada unggas.

Pengantar metode diagnostik (analitis)

Untuk analisis laboratorium, metode klasik untuk deteksi langsung dan tidak langsung seperti serologi dan PCR langsung terlintas di pikiran kita. Namun, metode pengujian resistensi seperti pengujian konsentrasi hambat minimum (MIC) juga sangat diperlukan. Teknik modern berbasis metode molekuler juga sedang berkembang, seperti whole genome sequencing yang sebelumnya terhambat oleh biayanya yang sangat tinggi.

Isolasi dibutuhkan untuk pengujian resistensi

Dalam kelompok uji langsung, standar utama untuk diagnosis mikoplasma adalah isolasi.

Isolasi juga merupakan prasyarat untuk melakukan pengujian resistensi, misalnya melalui tes MIC. Saat ini, metode ini menjadi pilihan utama untuk mengevaluasi profil resistensi dari strain mikoplasma. MIC memiliki kapasitas throughput tinggi dan dapat distandarisasi dengan mudah.

MG dan MS adalah organisme yang sangat rewel dan membutuhkan media kultur khusus untuk tumbuh. Media Frey biasanya digunakan, dan dapat memakan waktu hingga 10 hari atau lebih untuk mendapatkan hasil positif. Hal ini terlihat dari perubahan warna dalam media cair dan koloni berbentuk ‘telur goreng’ pada agar. Konfirmasi isolasi harus dilakukan dengan PCR atau imunofluoresensi.

Memperoleh nilai MIC menjadi semakin penting untuk menetapkan profil resistensi antibiotik dari strain lokal dan memilih pengobatan yang tepat. Data MIC tersedia di seluruh dunia. Namun, sangat penting memiliki MIC untuk setiap operasi/sentra unggas agar strategi pengendalian yang tepat dapat ditentukan untuk setiap wilayah. Informasi tentang tingkat MIC tidak tersedia di banyak operasi/sentra unggas, baik di tingkat produksi/farm maupun nasional.

Karena kesulitan dalam isolasi, penelitian terus dilakukan untuk menentukan resistensi mikoplasma terhadap antibiotik dengan teknik baru. Salah satunya adalah deteksi mutasi pada gen rRNA 23s, yang dicurigai menurunkan sensitivitas terhadap makrolida. Penelitian sedang berlangsung untuk menentukan apakah mutasi tersebut dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk menentukan batas ambang resistensi. Proteomik – studi tentang protein yang diproduksi oleh organisme – dapat digunakan untuk mendeteksi bagaimana mikoplasma memproduksi atau memodifikasi ekspresi enzimnya. Secara teori, aktivitas enzim dapat dijadikan indikator perkembangan resistensi terhadap berbagai antibiotik.

PCR dan alat molekuler lainnya

Deteksi molekuler semakin penting dalam diagnostik mikoplasma. Teknik deteksi langsung paling populer adalah PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang sangat baik. Tidak seperti isolasi, PCR tidak dapat membedakan antara organisme hidup dan mati.

Sampel PCR dapat diambil melalui usap choanal atau trakea, maserasi organ, atau cairan sendi. DNA diekstrak dan dapat digunakan untuk PCR real-time atau PCR klasik dengan sekuensing lanjutan. PCR dapat mendeteksi MS dan MG dari sampel yang sama secara bersamaan. PCR semi-kuantitatif (qPCR) sangat berguna untuk menentukan jumlah materi genetik.

Jumlah materi genetik dalam sampel dihitung berdasarkan jumlah siklus yang diperlukan untuk mendeteksinya. Satuan yang digunakan disebut ambang siklus (cycle threshold). qPCR dapat digunakan untuk menentukan efek intervensi terhadap beban mikoplasma di lapangan.

PCR yang diikuti sekuensing adalah prasyarat untuk membuat pohon filogenetik guna menarik kesimpulan tentang epidemiologi. Epidemiologi digunakan untuk membedakan antara strain lapangan dan vaksin, serta untuk menilai keberhasilan pengendalian strategis.

Gambar 1. Kegunaan PCR semi-kuantitatif untuk mengevaluasi keberhasilan pengobatan.

Pengobatan dapat mengurangi beban mikoplasma secara keseluruhan sebagaimana dibuktikan oleh peningkatan ambang siklus. Namun, hasil qPCR harus ditafsirkan hati-hati karena juga dapat mendeteksi mikoplasma yang tidak hidup.

Hal ini harus diperhitungkan saat menentukan waktu pengambilan sampel. Dengan pola pelepasan mikoplasma yang bersifat intermiten, PCR sangat berguna untuk mengetahui status infeksi saat ini dan membantu interpretasi hasil serologi.

PCR sering digunakan untuk mengetahui apakah ayam sudah terinfeksi pada waktu tertentu. Contohnya adalah saat pemindahan ayam dara ke kandang produksi, di mana hasil PCR bisa menunjukkan keberadaan mikoplasma sebelum antibodi berkembang. Jika mikoplasma hadir, tingkat antibodi akan meningkat setelah stres akibat pemindahan atau saat mulai bertelur.

Serologi – dasar-dasarnya

Serologi adalah teknik tidak langsung untuk mendeteksi respons hewan terhadap patogen melalui pengukuran tingkat antibodi. Validitas metode ini sangat bergantung pada perencanaan dan pelaksanaan pengambilan sampel yang benar. Interpretasi tingkat antibodi suatu flok hanya signifikan jika pengambilan sampel dilakukan secara andal dan representatif serta disimpan dan ditangani dengan tepat.

Koefisien variasi (%CV) adalah ukuran penting dalam validitas uji serologi karena menunjukkan deviasi standar untuk interpretasi statistik yang tepat. Ukuran sampel sangat penting untuk memperoleh hasil yang andal dan dapat direproduksi. Banyak publikasi telah menjelaskan bagaimana menentukan ukuran sampel yang tepat.

Sering kali di lapangan, ukuran sampel serologi tidak memadai, sehingga perlu ditegaskan bahwa jumlah sampel yang terlalu sedikit akan sangat mengurangi keandalan rata-rata titer dan estimasi vaksinasi.

Waktu pengambilan sampel yang tepat juga sangat penting. Sampel serum sebaiknya diambil secara berkala atau setidaknya dalam pasangan untuk menentukan apakah titer meningkat atau menurun. Ini memungkinkan kesimpulan penting tentang perkembangan penyakit dan keberhasilan intervensi di lapangan. Oleh karena itu, ELISA sangat direkomendasikan terutama pada flok pembibit maupun petelur.

ELISA

Teknik ELISA didasarkan pada deteksi antigen atau antibodi dengan mengikatkan pada lawannya pada pelat 96 sumur. Dalam semua metode serologi, derajat reaktivitas silang dapat terjadi tergantung pada agen pengikat dan sifat imunologisnya. Hal ini juga berlaku untuk ELISA.

Keunggulan ELISA adalah relatif murah, cepat, cukup spesifik dan sensitif, serta mudah diautomatisasi. Teknik ini memungkinkan interpretasi kuantitatif dari rentang titer dan perkembangan penyakit, sehingga sangat penting pada penyakit yang menyebar lambat seperti mikoplasma.

Interpretasi hasil membutuhkan pengalaman, biasanya diperoleh dengan menganalisis dan membandingkan data terbaru dengan data yang telah diperoleh sebelumnya di suatu operasi atau bahkan tingkat flok.

Penyimpangan dari garis dasar yang sudah ditetapkan menjadi indikator penting dalam program strategi pengendalian mikoplasma, hal ini bisa menyebabkan perubahan kesimpulan tentang seluruh tantangan mikoplasma di lapangan dan status vaksin.

Gambar 2. Titer MG yang meningkat selama siklus produksi pada flok layer yang divaksinasi live.

Gambar 2. Menunjukkan Nilai titer MG meningkat perlahan selama siklus produksi flok petelur yang divaksin live. 30 sampel diambil dengan variasi nilai CV. Yang ditampilkan adalah nilai GMT.

Kenaikan melebihi nilai titer 3.000 bertepatan dengan munculnya tanda-tanda penyakit MG pada sebagian flok dan penurunan produksi telur.

Nilai titer akan bervariasi tergantung banyak faktor seperti pemasok kit, status vaksinasi, tingkat tantangan di lapangan, dll.

Oleh karena itu, nilai tersebut harus ditafsirkan dengan hati-hati dan tidak dianggap sebagai ambang tetap. Ini menunjukkan bagaimana bukti diagnostik, data produksi, dan presentasi penyakit bekerja bersama dalam diagnosis penyakit yang tepat.

Aglutinasi pelat cepat (Rapid Plate Agglutination)

Teknik ini didasarkan pada kemampuan aglutinasi dari antigen yang diketahui dengan antibodi yang tidak diketahui.

RPA sering digunakan sebagai teknik skrining untuk flok negatif. Namun, hasil positif biasanya perlu dikonfirmasi dengan metode lain.

Uji Hambatan Hemaglutinasi (Hemagglutination Inhibition/HI)

Metode HI secara teori kurang sensitif, namun lebih spesifik daripada RPA dan ELISA. Salah satu kelemahannya adalah memerlukan waktu lebih lama dan pengalaman lebih untuk dilakukan dengan benar.

Kesimpulan

Kesimpulan dari metode diagnostik positif yang telah dijelaskan akan kehilangan kegunaannya jika tidak tersedia data penyakit dan produksi dari lapangan untuk memahami konteks penyakit secara keseluruhan.

Diagnosis yang tepat bergantung pada metode diagnostik atau titer yang telah dijelaskan. Diagnosis juga bergantung pada tanda-tanda klinis penyakit dan status data produksi. Semua aspek ini perlu dipertimbangkan untuk memahami dampak mikoplasma terhadap produksi.

Teknik-teknik yang dijelaskan dapat digunakan untuk mengevaluasi efektivitas intervensi yang direncanakan dan program pengendalian strategis. Intervensi biasanya ditujukan untuk meningkatkan data produksi, namun keberhasilannya juga sering dievaluasi berdasarkan penurunan beban mikoplasma (lihat kotak qPCR) serta perkembangan titer ELISA. Untuk menentukan keberhasilan suatu intervensi, indikator kinerja utama perlu dipilih dengan cermat sejak awal

oleh Dr. med.-vet. Esther Schonewille, Global Poultry Technical Support Manager, dan Esp. Med. Vet. Javier Uriarte, LATAM Technical Service Manager, ECO Animal Health. www.ecoanimalhealth.com